細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作流程
細(xì)胞復(fù)蘇：
1. 將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水浴鍋中回溫，回溫后噴以75%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。如配置：50mL*培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青雙抗) 44.5mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ 5mL FBS + 0.5mL青雙抗。
2. 戴防護手套后，自液氮罐中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，立即放入37℃水槽中快速解凍（避冰晶重新結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡），輕搖冷凍管使其在2分鐘內(nèi)全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。
3. 將解凍的1mL細(xì)胞懸液緩緩加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，再向瓶中加入10mL*培養(yǎng)基(稀釋比例為1:10)，混合均勻，放入37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取0.1ml解凍胞懸液作存活測試。(Sf9細(xì)胞在27℃生長，可不需CO2)
4. 一般而言，細(xì)胞大都不需立即去除冷凍保護劑(例如DMSO)。若要立即去除，則將解凍的細(xì)胞懸液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離1300rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO
2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
傳代培養(yǎng)：
1.37℃恒溫培養(yǎng)約48小時，待細(xì)胞長滿80-90%后，從培養(yǎng)箱取出75cm
2培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清，倒掉緩沖液。
2.沿壁（無細(xì)胞的一面）緩緩加入1mL溶液消化細(xì)胞約
1min，輕輕搖晃，倒掉殘余，將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中約1min，拿出培養(yǎng)瓶輕輕拍打一下細(xì)胞貼壁的一面。
注意：消化溫度是37℃，加液后用移液管反復(fù)吹打分散細(xì)胞。
3.向瓶中加入5mL*培養(yǎng)基，反復(fù)吹打均勻2min，從中取出至0.5ml小離心管中，向管中加入80μl臺盼藍溶液，混勻，從混合液中取出10μl至蓋好蓋玻片的計數(shù)板上，計算細(xì)胞密度及活率。
4.將5mL細(xì)胞懸液全部吸出，分別接種1mL懸液到原培養(yǎng)基瓶和另一新的培養(yǎng)瓶中，其余舍棄。再向兩瓶中各加入10mL*培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱養(yǎng)。（細(xì)胞傳代時按1：5或更大比例稀釋）
上一篇 淋巴細(xì)胞脈絡(luò)膜 下一篇 干細(xì)胞治療成果
